JavaScript er i øjeblikket deaktiveret i din browser.Når javascript er deaktiveret, vil nogle funktioner på denne hjemmeside ikke fungere.
Registrer dine specifikke detaljer og specifikke lægemidler af interesse, og vi vil matche de oplysninger, du giver, med artikler i vores omfattende database og sende dig en PDF-kopi via e-mail rettidigt.
Styr bevægelsen af ​​magnetiske jernoxidnanopartikler til målrettet levering af cytostatika
Forfatter Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O.
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazov National Medical Forskningscenter for Sundhedsministeriet i Den Russiske Føderation, St. Petersborg, 197341, Den Russiske Føderation;2 St. Petersburg Electrotechnical University "LETI", St. Petersburg, 197376, Den Russiske Føderation;3 Center for Personlig Medicin, Almazov State Medical Research Center, Den Russiske Føderations sundhedsministerium, St. Petersborg, 197341, Ruslands Føderation;4FSBI "Influenza Research Institute opkaldt efter AA Smorodintsev" Sundhedsministeriet i Den Russiske Føderation, Skt. Petersborg, Den Russiske Føderation;5 Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russian Federation;6 RAS Institute of Cytology, St. Petersburg, 194064, Den Russiske Føderation;7INSERM U1231, Fakultet for Medicin og Farmaci, Bourgogne-Franche Comté Universitetet i Dijon, Frankrig Kommunikation: Yana Toropova Almazov National Medical Research Centre, Ministeriet for Sundhed i Den Russiske Føderation, Sankt Petersborg, 197341, Den Russiske Føderation Tlf. +7 981 95264806 95264806 [email protected] Baggrund: En lovende tilgang til problemet med cytostatisk toksicitet er brugen af ​​magnetiske nanopartikler (MNP) til målrettet lægemiddellevering.Formål: At bruge beregninger til at bestemme de bedste karakteristika for det magnetiske felt, der styrer MNP'er in vivo, og til at evaluere effektiviteten af ​​magnetronlevering af MNP'er til musetumorer in vitro og in vivo.(MNPs-ICG) anvendes.In vivo luminescensintensitetsundersøgelser blev udført i tumormus, med og uden et magnetfelt på stedet af interesse.Disse undersøgelser blev udført på et hydrodynamisk stillads udviklet af Institut for Eksperimentel Medicin ved Almazov State Medical Research Center i det russiske sundhedsministerium.Resultat: Brugen af ​​neodymmagneter fremmede den selektive akkumulering af MNP.Et minut efter administration af MNPs-ICG til tumorbærende mus akkumuleres MNPs-ICG hovedsageligt i leveren.I fravær og tilstedeværelse af et magnetfelt indikerer dette dets metaboliske vej.Selvom en stigning i fluorescensen i tumoren blev observeret i nærvær af et magnetfelt, ændrede fluorescensintensiteten i dyret sig ikke over tid.Konklusion: Denne type MNP, kombineret med den beregnede magnetfeltstyrke, kan være grundlaget for udviklingen af ​​magnetisk styret levering af cytostatika til tumorvæv.Nøgleord: fluorescensanalyse, indocyanin, jernoxidnanopartikler, magnetronlevering af cytostatika, tumormålretning
Tumorsygdomme er en af ​​de vigtigste dødsårsager på verdensplan.Samtidig eksisterer dynamikken i stigende morbiditet og dødelighed af tumorsygdomme stadig.1 Den kemoterapi, der anvendes i dag, er stadig en af ​​de vigtigste behandlinger for forskellige tumorer.Samtidig er udviklingen af ​​metoder til at reducere den systemiske toksicitet af cytostatika stadig relevant.En lovende metode til at løse dets toksicitetsproblem er at bruge nanoskalabærere til at målrette lægemiddelleveringsmetoder, som kan give lokal akkumulering af lægemidler i tumorvæv uden at øge deres akkumulering i sunde organer og væv.koncentration.2 Denne metode gør det muligt at forbedre effektiviteten og målretningen af ​​kemoterapeutiske lægemidler på tumorvæv, samtidig med at deres systemiske toksicitet reduceres.
Blandt de forskellige nanopartikler, der overvejes til målrettet levering af cytostatiske midler, er magnetiske nanopartikler (MNP'er) af særlig interesse på grund af deres unikke kemiske, biologiske og magnetiske egenskaber, som sikrer deres alsidighed.Derfor kan magnetiske nanopartikler bruges som varmesystem til behandling af tumorer med hypertermi (magnetisk hypertermi).De kan også bruges som diagnostiske midler (magnetisk resonansdiagnose).3-5 Ved at bruge disse egenskaber, kombineret med muligheden for MNP-akkumulering i et specifikt område, gennem brug af et eksternt magnetfelt, åbner leveringen af ​​målrettede farmaceutiske præparater op for skabelsen af ​​et multifunktionelt magnetronsystem til at målrette cytostatika til tumorstedet Udsigter.Et sådant system ville omfatte MNP og magnetiske felter til at kontrollere deres bevægelse i kroppen.I dette tilfælde kan både eksterne magnetiske felter og magnetiske implantater placeret i det kropsområde, der indeholder tumoren, bruges som kilden til det magnetiske felt.6 Den første metode har alvorlige mangler, herunder behovet for at bruge specialudstyr til magnetisk målretning af lægemidler og behovet for at uddanne personale til at udføre operation.Derudover er denne metode begrænset af høje omkostninger og er kun egnet til "overfladiske" tumorer tæt på kroppens overflade.Den alternative metode til at bruge magnetiske implantater udvider anvendelsesområdet for denne teknologi, hvilket letter dens anvendelse på tumorer placeret i forskellige dele af kroppen.Både individuelle magneter og magneter integreret i den intraluminale stent kan bruges som implantater til tumorskader i hule organer for at sikre deres åbenhed.Men ifølge vores egen upublicerede forskning er disse ikke tilstrækkeligt magnetiske til at sikre tilbageholdelse af MNP fra blodbanen.
Effektiviteten af ​​magnetron-lægemiddellevering afhænger af mange faktorer: egenskaberne af selve den magnetiske bærer og egenskaberne af magnetfeltkilden (herunder de geometriske parametre for permanente magneter og styrken af ​​det magnetiske felt, de genererer).Udviklingen af ​​vellykket magnetisk styret cellehæmmer-leveringsteknologi bør involvere udvikling af passende magnetiske nanoskala-lægemiddelbærere, vurdering af deres sikkerhed og udvikling af en visualiseringsprotokol, der gør det muligt at spore deres bevægelser i kroppen.
I denne undersøgelse beregnede vi matematisk de optimale magnetfeltkarakteristika til at kontrollere den magnetiske lægemiddelbærer i nanoskala i kroppen.Muligheden for at tilbageholde MNP gennem blodkarvæggen under påvirkning af et påført magnetfelt med disse beregningsmæssige egenskaber blev også undersøgt i isolerede rotteblodkar.Derudover syntetiserede vi konjugater af MNP'er og fluorescerende midler og udviklede en protokol til deres visualisering in vivo.Under in vivo-betingelser i tumormodelmus blev akkumuleringseffektiviteten af ​​MNP'er i tumorvæv undersøgt, når de blev administreret systemisk under påvirkning af et magnetfelt.
I in vitro undersøgelsen brugte vi referencen MNP, og i in vivo undersøgelsen brugte vi MNP coatet med mælkesyrepolyester (polymælkesyre, PLA) indeholdende et fluorescerende middel (indolcyanin; ICG).MNP-ICG er inkluderet i I tilfældet, brug (MNP-PLA-EDA-ICG).
MNP's syntese og fysiske og kemiske egenskaber er blevet beskrevet i detaljer andetsteds.7,8
For at syntetisere MNP'er-ICG blev der først produceret PLA-ICG-konjugater.En racemisk pulverblanding af PLA-D og PLA-L med en molekylvægt på 60 kDa blev anvendt.
Da PLA og ICG begge er syrer, skal man for at syntetisere PLA-ICG-konjugater først syntetisere en aminotermineret spacer på PLA, som hjælper ICG med at kemisorbere til spaceren.Spaceren blev syntetiseret under anvendelse af ethylendiamin (EDA), carbodiimidmetode og vandopløseligt carbodiimid, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC).PLA-EDA spaceren syntetiseres som følger.Tilsæt 20 gange molært overskud af EDA og 20 gange molært overskud af EDAC til 2 ml 0,1 g/ml PLA chloroformopløsning.Syntesen blev udført i et 15 ml polypropylenreagensglas på en rystemaskine ved en hastighed på 300 min-1 i 2 timer.Synteseskemaet er vist i figur 1. Gentag syntesen med et 200 gange overskud af reagenser for at optimere synteseskemaet.
Ved afslutningen af ​​syntesen blev opløsningen centrifugeret ved en hastighed på 3000 min-1 i 5 minutter for at fjerne overskydende udfældede polyethylenderivater.Derefter blev 2 ml af en 0,5 mg/ml ICG-opløsning i dimethylsulfoxid (DMSO) tilsat til 2 ml-opløsningen.Omrøreren fikseres ved en omrøringshastighed på 300 min-1 i 2 timer.Det skematiske diagram af det opnåede konjugat er vist i figur 2.
I 200 mg MNP tilsatte vi 4 ml PLA-EDA-ICG-konjugat.Brug en LS-220 shaker (LOIP, Rusland) til at omrøre suspensionen i 30 minutter med en frekvens på 300 min-1.Derefter blev det vasket med isopropanol tre gange og underkastet magnetisk adskillelse.Brug UZD-2 Ultrasonic Disperser (FSUE NII TVCH, Rusland) til at tilføje IPA til suspensionen i 5-10 minutter under kontinuerlig ultralydsvirkning.Efter den tredje IPA-vask blev præcipitatet vasket med destilleret vand og resuspenderet i fysiologisk saltvand ved en koncentration på 2 mg/ml.
ZetaSizer Ultra-udstyret (Malvern Instruments, UK) blev brugt til at studere størrelsesfordelingen af ​​det opnåede MNP i den vandige opløsning.Et transmissionselektronmikroskop (TEM) med en JEM-1400 STEM feltemissionskatode (JEOL, Japan) blev brugt til at studere formen og størrelsen af ​​MNP.
I denne undersøgelse bruger vi cylindriske permanente magneter (N35-kvalitet; med nikkelbeskyttende belægning) og følgende standardstørrelser (langakselængde × cylinderdiameter): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm og 5×2 mm.
In vitro-undersøgelsen af ​​MNP-transport i modelsystemet blev udført på et hydrodynamisk stillads udviklet af Institut for Eksperimentel Medicin ved Almazov State Medical Research Center i det russiske sundhedsministerium.Volumenet af den cirkulerende væske (destilleret vand eller Krebs-Henseleit-opløsning) er 225 ml.Aksialt magnetiserede cylindriske magneter bruges som permanente magneter.Placer magneten på en holder 1,5 mm væk fra indervæggen af ​​det centrale glasrør, med dens ende i retning af røret (lodret).Væskestrømningshastigheden i den lukkede sløjfe er 60 L/h (svarende til en lineær hastighed på 0,225 m/s).Krebs-Henseleit-opløsning bruges som en cirkulerende væske, fordi den er en analog af plasma.Den dynamiske viskositetskoefficient for plasma er 1,1-1,3 mPa∙s.9 Mængden af ​​MNP adsorberet i magnetfeltet bestemmes ved spektrofotometri ud fra koncentrationen af ​​jern i den cirkulerende væske efter forsøget.
Derudover er der udført eksperimentelle undersøgelser af en forbedret væskemekanisk tabel for at bestemme den relative permeabilitet af blodkar.Hovedkomponenterne i den hydrodynamiske støtte er vist i figur 3. Hovedkomponenterne i den hydrodynamiske stent er en lukket sløjfe, der simulerer tværsnittet af modelkarsystemet og en lagertank.Bevægelsen af ​​modelvæsken langs konturen af ​​blodkarmodulet tilvejebringes af en peristaltisk pumpe.Under eksperimentet skal du opretholde fordampningen og det nødvendige temperaturområde og overvåge systemparametrene (temperatur, tryk, væskeflowhastighed og pH-værdi).
Figur 3 Blokdiagram over den opstilling, der bruges til at studere permeabiliteten af ​​halspulsårevæggen.1-opbevaringstank, 2-peristaltisk pumpe, 3-mekanisme til indføring af suspension indeholdende MNP i sløjfen, 4-flowmåler, 5-trykssensor i sløjfen, 6-varmeveksler, 7-kammer med beholder, 8-kilden af magnetfeltet, 9-ballonen med kulbrinter.
Kammeret, der indeholder beholderen, består af tre beholdere: en ydre stor beholder og to små beholdere, gennem hvilke armene i det centrale kredsløb passerer.Kanylen sættes ind i den lille beholder, beholderen snores på den lille beholder, og spidsen af ​​kanylen bindes tæt med en tynd tråd.Rummet mellem den store beholder og den lille beholder fyldes med destilleret vand, og temperaturen forbliver konstant på grund af forbindelsen til varmeveksleren.Rummet i den lille beholder er fyldt med Krebs-Henseleit-opløsning for at opretholde levedygtigheden af ​​blodkarceller.Tanken er også fyldt med Krebs-Henseleit opløsning.Gasforsyningssystemet (kulstof) bruges til at fordampe opløsningen i den lille beholder i lagertanken og kammeret, der indeholder beholderen (Figur 4).
Figur 4 Kammeret, hvor beholderen er placeret.1-kanyle til sænkning af blodkar, 2-ydre kammer, 3-lille kammer.Pilen angiver modelvæskens retning.
For at bestemme det relative permeabilitetsindeks for karvæggen blev rottehalspulsåren anvendt.
Indføringen af ​​MNP-suspension (0,5 ml) i systemet har følgende karakteristika: det samlede indre volumen af ​​tanken og forbindelsesrøret i løkken er 20 ml, og det indre volumen af ​​hvert kammer er 120 ml.Den eksterne magnetfeltkilde er en permanent magnet med en standardstørrelse på 2×3 mm.Den er installeret over et af de små kamre, 1 cm væk fra beholderen, med den ene ende mod beholderens væg.Temperaturen holdes på 37°C.Valsepumpens effekt er indstillet til 50 %, hvilket svarer til en hastighed på 17 cm/s.Som kontrol blev prøver udtaget i en celle uden permanente magneter.
En time efter indgivelsen af ​​en given koncentration af MNP blev en væskeprøve udtaget fra kammeret.Partikelkoncentrationen blev målt med et spektrofotometer under anvendelse af Unico 2802S UV-Vis spektrofotometer (United Products & Instruments, USA).Under hensyntagen til absorptionsspektret af MNP-suspensionen blev målingen udført ved 450 nm.
I henhold til Rus-LASA-FELASA-retningslinjerne opdrættes og opdrættes alle dyr i specifikke patogenfrie faciliteter.Denne undersøgelse overholder alle relevante etiske regler for dyreforsøg og forskning og har opnået etisk godkendelse fra Almazov National Medical Research Center (IACUC).Dyrene drak vand ad libitum og fodrede regelmæssigt.
Undersøgelsen blev udført på 10 bedøvede 12 uger gamle han-immundefekte NSG-mus (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, USA) 10, der vejede 22 g ± 10%.Eftersom immundefektmusens immunitet undertrykkes, tillader immundefektmusene i denne linje transplantation af humane celler og væv uden transplantatafstødning.Kuldkammeraterne fra forskellige bure blev tilfældigt tildelt forsøgsgruppen, og de blev co-avlet eller systematisk udsat for strøelse fra andre grupper for at sikre lige stor eksponering for den almindelige mikrobiota.
Den humane HeLa-kræftcellelinje bruges til at etablere en xenograft-model.Cellerne blev dyrket i DMEM indeholdende glutamin (PanEco, Rusland), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, USA), 100 CFU/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin.Cellelinjen blev venligst stillet til rådighed af Gene Expression Regulation Laboratory fra Institute of Cell Research ved det russiske videnskabsakademi.Før injektion blev HeLa-celler fjernet fra kulturplasten med en 1:1 trypsin:Versene-opløsning (Biolot, Rusland).Efter vask blev cellerne suspenderet i komplet medium til en koncentration på 5×106 celler pr. 200 μL og fortyndet med basalmembranmatrix (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, på is).Den fremstillede cellesuspension blev injiceret subkutant i huden på muselåret.Brug elektroniske skydelære til at overvåge tumorvækst hver 3. dag.
Da tumoren nåede 500 mm3, blev en permanent magnet implanteret i muskelvævet på forsøgsdyret nær tumoren.I forsøgsgruppen (MNPs-ICG + tumor-M) blev 0,1 ml MNP-suspension injiceret og udsat for et magnetfelt.Ubehandlede hele dyr blev anvendt som kontroller (baggrund).Derudover blev dyr injiceret med 0,1 ml MNP, men ikke implanteret med magneter (MNPs-ICG + tumor-BM), anvendt.
Fluorescensvisualiseringen af ​​in vivo og in vitro prøver blev udført på IVIS Lumina LT serie III bioimager (PerkinElmer Inc., USA).Til in vitro-visualisering blev et volumen på 1 ml syntetisk PLA-EDA-ICG og MNP-PLA-EDA-ICG-konjugat tilsat til pladebrøndene.Under hensyntagen til ICG-farvestoffets fluorescensegenskaber vælges det bedste filter, der bruges til at bestemme lysintensiteten af ​​prøven: den maksimale excitationsbølgelængde er 745 nm, og emissionsbølgelængden er 815 nm.Living Image 4.5.5-softwaren (PerkinElmer Inc.) blev brugt til kvantitativt at måle fluorescensintensiteten af ​​brøndene indeholdende konjugatet.
Fluorescensintensiteten og akkumuleringen af ​​MNP-PLA-EDA-ICG-konjugatet blev målt i in vivo-tumormodelmus uden tilstedeværelsen og påføringen af ​​et magnetfelt på stedet af interesse.Musene blev bedøvet med isofluran, og derefter blev 0,1 ml MNP-PLA-EDA-ICG-konjugat injiceret gennem halevenen.Ubehandlede mus blev anvendt som en negativ kontrol for at opnå en fluorescerende baggrund.Efter indgivelse af konjugatet intravenøst ​​placeres dyret på et varmetrin (37°C) i kammeret i IVIS Lumina LT serie III fluorescensbilledkameraet (PerkinElmer Inc.), mens inhalationen opretholdes med 2 % isofluranbedøvelse.Brug ICG's indbyggede filter (745–815 nm) til signaldetektion 1 minut og 15 minutter efter introduktionen af ​​MNP.
For at vurdere akkumuleringen af ​​konjugat i tumoren blev dyrets peritoneale område dækket med papir, hvilket gjorde det muligt at eliminere den lyse fluorescens forbundet med ophobning af partikler i leveren.Efter at have studeret biofordelingen af ​​MNP-PLA-EDA-ICG blev dyrene aflivet humant ved en overdosis af isofluranæstesi til efterfølgende adskillelse af tumorområder og kvantitativ vurdering af fluorescensstråling.Brug Living Image 4.5.5-software (PerkinElmer Inc.) til manuelt at behandle signalanalysen fra det valgte område af interesse.Der blev taget tre målinger for hvert dyr (n = 9).
I denne undersøgelse kvantificerede vi ikke den vellykkede belastning af ICG på MNP'er-ICG.Derudover sammenlignede vi ikke retentionseffektiviteten af ​​nanopartikler under påvirkning af permanente magneter af forskellige former.Derudover evaluerede vi ikke den langsigtede effekt af magnetfeltet på tilbageholdelsen af ​​nanopartikler i tumorvæv.
Nanopartikler dominerer med en gennemsnitlig størrelse på 195,4 nm.Derudover indeholdt suspensionen agglomerater med en gennemsnitlig størrelse på 1176,0 nm (figur 5A).Efterfølgende blev portionen filtreret gennem et centrifugalfilter.Partiklernes zeta-potentiale er -15,69 mV (figur 5B).
Figur 5 Suspensionens fysiske egenskaber: (A) partikelstørrelsesfordeling;(B) partikelfordeling ved zeta-potentiale;(C) TEM-fotografi af nanopartikler.
Partikelstørrelsen er grundlæggende 200 nm (figur 5C), sammensat af en enkelt MNP med en størrelse på 20 nm og en PLA-EDA-ICG konjugeret organisk skal med en lavere elektrondensitet.Dannelsen af ​​agglomerater i vandige opløsninger kan forklares med det relativt lave modul af den elektromotoriske kraft af individuelle nanopartikler.
For permanente magneter, når magnetiseringen er koncentreret i volumen V, opdeles integraludtrykket i to integraler, nemlig volumenet og overfladen:
I tilfælde af en prøve med konstant magnetisering er strømtætheden nul.Derefter vil ekspressionen af ​​den magnetiske induktionsvektor tage følgende form:
Brug MATLAB-programmet (MathWorks, Inc., USA) til numerisk beregning, ETU "LETI" akademisk licensnummer 40502181.
Som vist i Figur 7 Figur 8 Figur 9 Figur-10, er det stærkeste magnetfelt genereret af en magnet orienteret aksialt fra enden af ​​cylinderen.Den effektive aktionsradius svarer til magnetens geometri.I cylindriske magneter med en cylinder, hvis længde er større end dens diameter, observeres det stærkeste magnetfelt i aksial-radial retning (for den tilsvarende komponent);derfor er et par cylindre med et større aspektforhold (diameter og længde) MNP-adsorption den mest effektive.
Fig. 7 Komponenten af ​​den magnetiske induktionsintensitet Bz langs magnetens Oz-akse;magnetens standardstørrelse: sort streg 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grøn linje 3×2 mm, rød linje 5×2 mm.
Figur 8 Den magnetiske induktionskomponent Br er vinkelret på magnetaksen Oz;magnetens standardstørrelse: sort streg 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grøn linje 3×2 mm, rød linje 5×2 mm.
Figur 9 Den magnetiske induktionsintensitet Bz-komponent i afstanden r fra magnetens endeakse (z=0);magnetens standardstørrelse: sort streg 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grøn linje 3×2 mm, rød linje 5×2 mm.
Figur 10 Magnetisk induktionskomponent langs den radiale retning;standard magnetstørrelse: sort streg 0,5×2 mm, blå linje 2×2 mm, grøn linje 3×2 mm, rød linje 5×2 mm.
Specielle hydrodynamiske modeller kan bruges til at studere metoden til MNP-levering til tumorvæv, koncentrere nanopartikler i målområdet og bestemme nanopartiklers opførsel under hydrodynamiske forhold i kredsløbssystemet.Permanente magneter kan bruges som eksterne magnetfelter.Hvis vi ignorerer den magnetostatiske interaktion mellem nanopartiklerne og ikke overvejer den magnetiske væskemodel, er det tilstrækkeligt at estimere interaktionen mellem magneten og en enkelt nanopartikel med en dipol-dipol tilnærmelse.
Hvor m er magnetens magnetiske moment, r er radiusvektoren for det punkt, hvor nanopartiklerne er placeret, og k er systemfaktoren.I dipoltilnærmelsen har magnetens felt en lignende konfiguration (figur 11).
I et ensartet magnetfelt roterer nanopartiklerne kun langs kraftlinjerne.I et uensartet magnetfelt virker kraft på det:
Hvor er den afledede af en given retning l.Derudover trækker kraften nanopartiklerne ind i de mest ujævne områder af feltet, det vil sige, at krumningen og tætheden af ​​kraftlinjerne øges.
Derfor er det ønskeligt at anvende en tilstrækkelig stærk magnet (eller magnetkæde) med tydelig aksial anisotropi i det område, hvor partiklerne befinder sig.
Tabel 1 viser evnen af ​​en enkelt magnet som en tilstrækkelig magnetisk feltkilde til at fange og fastholde MNP i det vaskulære leje af applikationsfeltet.